文章标题：【论著】尿源性干细胞的外泌体修复骨不连的作用研究

文章作者：刘一飞　王宇辰　朱　昱　褚光宇　汪秋柯　陈云丰
关 键 字：外泌体；尿源性干细胞；骨不连；血管再生
文章摘要：

目的　评估尿源性干细胞（ＵＳＣ）的外泌体（Ｅｘｏｓ）能否促进骨不连的愈合，并探讨其作用机制。方法　从人尿液中提取并培养ＵＳＣ，采用超滤法提取ＵＳＣ 来源的Ｅｘｏｓ（ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ）用于研究。应用透射电子显微镜检测ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ的形态和粒径，应用ＱＮａｎｏ平台检测ＵＳＣＥｘｏｓ的大小和密度。体外实验：取新鲜分离的ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ悬液，按照不同密度０、１０７、１０８ 个／ｍＬ 分别配制新的含有ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ 的人脐静脉内皮细胞（ＨｕＶＥＣｓ）完全培养基，对应分组为对照组、ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组、ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组。进行ＣＣＫ-８细胞增殖实验、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移实验、成管实验，验证ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ促进ＨｕＶＥＣｓ增殖、迁移、成管作用。体内实验：构建大鼠股骨骨不连的动物模型，将３０只大鼠随机分为空白组（向骨不连周围注射５００μＬＰＢＳ）、不含ＵＳＣＥｘｏｓ的纯光致亚胺交联凝胶（ｐｉＧＥＬ）组（ｐｉＧＥＬ 组，向骨不连周围注射５００μＬｐｉＧＥＬ）、含有１０９／ｍＬ ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ的ＵＳＣＥｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组（ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组，向骨不连周围注射５００μＬ ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 复合体），每组１０只。分别于术后第４、８周行Ｘ 线摄片、ｍｉｃｒｏ-ＣＴ 检查和组织学检查，术后第８周对组织切片进行免疫荧光检查，观察愈合情况和骨不连周围血管再生情况。结果　ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ直径约８０ｎｍ，形态呈类球形，有完整的膜结构，Ｅｘｏｓ悬液包含的ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ约为１．９７×１０１０个／ｍＬ，直径９０～１６０ｎｍ。ＣＣＫ-８增殖实验：细胞培养第４、５、６天，ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组和ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组ＨｕＶＥＣｓ的波长４５０ｎｍ 处吸光度（犃４５０）值均显著高于对照组同时间（P值均＜０．０５），ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组ＨｕＶＥＣｓ的犃４５０值显著高于ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组同时间（P值均＜０．０５）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移实验：ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组和ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组完成迁移的细胞数均显著多于对照组（P值均＜０．０５），ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组完成迁移的细胞数显著多于ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组（P＜０．０５）。成管实验：ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组和ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组的分支点均显著多于对照组（P值均＜０．０５），小管长度均显著长于对照组（P值均＜０．０５）；ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０８ 组的分支点显著多于ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组（P＜０．０５），小管长度显著长于ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ１０７ 组（P＜０．０５）。影像学检查：ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组在术后４周时，骨不连未修复，有骨痂形成，但仍有骨皮质不连续，骨缺损未完全愈合；第８周时，骨不连得到修复，骨皮质连续。ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组术后第４、８周骨不连处的骨体积分数均显著大于空白组和ｐｉＧＥＬ 组（P值均＜０．０５）。组织学检查：ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组骨不连断端骨皮质连续，新生的骨组织细胞排列尚不整齐，与正常骨组织间有明显的分界，细胞以骨细胞为主，少见骨髓细胞。免疫荧光检查：ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ-ｐｉＧＥＬ 组的血管内皮细胞较多，分布较密，围成的闭合管样结构完整，表明血管生成量较多。结论　ＵＳＣ-Ｅｘｏｓ能够促进大鼠股骨骨不连的愈合，其修复作用可能与促进骨不连周围血管再生有关。