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编辑出版:
《上海医学》编辑部
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上海市北京西路1623号
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200040
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邮箱:
smasmj@shsma.org.cn
ISSN:
ISSN0253-9934
CN:
CN31-1366/R
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稿件2012102000786重新投一次
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DOI:
作者:
杨雪莲
Yang Xuelian
作者单位:
上海市浦东新区公利医院
Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital
关键词:
小胶质细胞;神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂;组织型纤溶酶原激活剂; 信号通路
microglia;tissue plasminogen activator;neuroserpin;signaling pathway
摘要:
目的 观察小胶质细胞(microglia,MG)在缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)或组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,tPA)干预下被激活的主要信号通路,探讨神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Neuroserpin,NSP)抑制小胶质细胞进而产生神经保护作用的可能机制。方法 体外原代培养大鼠皮层小胶质细胞并鉴定,建立缺氧缺糖模型。细胞随机分为:正常组、tPA组(终浓度为0.05μg/μL干预细胞24h)、OGD3h组、NSP+tPA组(终浓度为0.025μg/μL的NSP预处理0.5h后,终浓度为0.05μg/μL的tPA干预24h)和NSP+ OGD3h组(终浓度为0.025μg/μL的NSP预处理0.5h后,OGD3h)。使用免疫荧光双标染色方法检测各干预组MAPK通路磷酸化蛋白的表达情况和核转录因子κB核移位情况。使用免疫印迹法检测各组MAPK通路磷酸化蛋白的表达量变化。结果 1、免疫荧光双标染色提示,小胶质细胞在正常状态下有少量ERK1/2以及p38通路磷酸化蛋白的表达,在tPA和OGD干预后磷酸化蛋白的表达明显增高。进一步使用Western blot结果分析:tPA和OGD干预组ERK1/2和p38通路的磷酸化水平较正常组比较均有明显增高,其中ERK1/2磷酸化水平增高更显著(P<0.01)。NSP预处理组磷酸化水平较干预组降低。小胶质细胞在正常状态和干预状态下均有JNK通路磷酸化蛋白较高量的表达,进一步使用Western blot结果分析:tPA和OGD干预后磷酸化蛋白的表达量也有轻度的增高,NSP预处理组表达降低。2、免疫荧光双标染色提示:在正常小胶质细胞中NF-κB主要存在于细胞胞浆中,在tPA和OGD干预后,NF-κB发生明显的核移位现象,主要在细胞核表达。各NSP预处理组NF-κB核移位现象明显减轻。结论 Ras/ERK,JNK/SAPK和p38通路对于小胶质细胞在tPA和OGD干预下的激活均起了一定的作用,其中ERK1/2和p38发挥了更重要的作用。tPA和OGD干预小胶质细胞后,NF-κB发生明显的核移位,此通路被激活。NSP预处理各干预组后,各条信号通路均被不同程度抑制。
Objective To study the signal transduction mechanism of microglia and to investigate the possible mechanism of the protective effects of NSP by inhibiting tPA which inhibiting the activity of microglia. Methods We used primary rat cultured cortical microglia and built the oxygen-glucose deprivation (OGD) model. The cells were randomly divided into five groups: normal group, tPA group(the final concentration was 0.05μg/μl, 24h), OGD3h group, NSP+tPA group (pretreated microglias with NSP for 0.5h and intervented it with tPA 24h) and NSP+OGD3h group. Expression of MAPK was identified by immunocytochemistry staining and was determined by Western-blot. The activation of NF-κB was determined by the immunofluoence double label method. Results The immunofluoence double label method showed that there was a small quantity expression of phospho-ERK and phosphor-p38 in normal microglias and the level increased obviously under the stimulation of tPA or OGD3h. Western blot showed the same results. The immunofluoence double label method showed that there were high expressions of phosphor-JNK both in normal microglias and the cells stimulated by tPA or OGD3h. Western blot showed that the expressions of phosphor-JNK in the cells stimulated by tPA or OGD3h were little higher than the normal ones. The immunofluoence double label method showed that NF-κB was actived by tPA or OGD. NSP group inhibited these signal transduction. Conclusions: TPA and OGD could activate ERK1/2 pathway, p38 pathway and JNK pathway of microglias. And ERK 1/2 pathway and p38 pathway were more important. NSP could inhibit these signal transduction by inhibiting tPA. TPA and OGD could also activate NF—κB. NSP could inhibit the activation of NF-κB.
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